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隨著結(jié)構(gòu)基因組學研究的不斷深入，基因組學的研究已經(jīng)進入結(jié)構(gòu)基因組學時代。結(jié)構(gòu)基因組學主要是在基因組范圍內(nèi)通過人為改變生物體或細胞內(nèi)基因的序列或表達狀態(tài)，觀察干預后的表型，從而建立基因型與表型間的關(guān)聯(lián)，闡述基因的功能。
今年五月底在 Cancer cell 上發(fā)表了一篇關(guān)于功能基因組學在研究癌癥藥物靶標領(lǐng)域的綜述，概述了癌癥藥物靶標篩選的不同體系，強調(diào)出不同體系之間的優(yōu)缺點，并對未來癌癥研究的工作做出展望。
這篇綜述主要討論了結(jié)合二代測序技術(shù)（Next-Generation Sequencing，NGS）與不同的人為干預基因序列和表達的技術(shù)，在篩選癌癥藥物靶點領(lǐng)域的應(yīng)用。其篩選策略和相關(guān)的技術(shù)原理如下圖所示：
功能缺失型篩選
功能缺失型篩選是通過人為下調(diào)靶基因的表達水平和功能活性，觀察表型的改變，從而鑒定出與特定表型相關(guān)的一組基因。
Cas9 或 Cas12a 核酸酶可通過雙鏈 DNA 斷裂和隨后目標外顯子（即灰色塊）內(nèi)的錯義修復引起功能缺失效應(yīng)；使用 dCas9-BE，可以對目標 DNA 進行化學修飾，在編碼序列的特定位點產(chǎn)生終止密碼子；通過 CRISPRi 的作用可以抑制轉(zhuǎn)錄，dCas9-suppressor 會在基因轉(zhuǎn)錄起始位點附近的染色質(zhì)或 DNA(即藍色高亮顯示的啟動子 / 增強子 DNA) 添加抑制標記；病毒載體和轉(zhuǎn)座酶的基因組整合可以將破壞性的轉(zhuǎn)基因添加到編碼序列中；mRNA 可以被裝載 siRNA 的 RNA 誘導沉默復合物（RISC) 或 gRNA 引導的 Cas13 核酸酶的靶向降解。
功能獲得型篩選
功能獲得型篩選是通過在細胞內(nèi)上調(diào)靶基因的表達水平，并觀測表型改變，建立基因與表型之間的聯(lián)系，闡述基因功能及相互作用網(wǎng)絡(luò)。
功能獲得表型可以通過將 dCas9 激活因子融合靶向基因的啟動子，經(jīng) CRISPRa 技術(shù)獲得；病毒載體能夠隨機將組成型表達或誘導表達的 ORFs/cDNA 整合到基因組中；使用病毒載體和轉(zhuǎn)座酶也可以隨機整合啟動子序列，從而激活附近基因的表達。
功能修飾型篩選
功能修飾型篩選是對目的蛋白的編碼基因進行改造，在短時間內(nèi)獲取靶位點氨基酸分別被其他 19 種天然氨基酸所替代的突變子的一種點飽和突變技術(shù)。
基于 dCas9 – BE 介導的編碼序列突變，會引起目的蛋白功能活性的改變；引入帶有單核苷酸變異（SNVs）的 ORFs 的病毒載體；或引入特定模板結(jié)合 Cas9 介導的 DNA 損傷的同源定向修復（HDR) 引入突變。
小編在這里對 RNAi 和 CRISPR 介導的幾種篩選體系進行了簡單的比較，如下圖所示：
上面所提到的，關(guān)于位點插入突變 / 激活篩選技術(shù)只適用于在單倍體細胞模型中篩選細胞適合度基因（cellfitness gene）。當然，隨著二代測序的發(fā)展，這種突變技術(shù)的應(yīng)用能力也將會進一步提升。
那么如何選擇點陣式篩選和混合式篩選呢？
在實驗中為了獲得更加可靠的結(jié)果，往往會將混合式篩選所得到的的基因再通過點陣式文庫驗證。
怎么選擇 Knock down、Knock out 或過表達技術(shù)呢？
某些基因 Knock down 后，往往表型不明顯，這時候選擇 Knock out 會使其表型更加明顯。然而對于細胞存活重要的基因，一旦被 Knock out 往往無法觀察細胞其他的表型。且對于多拷貝基因，當選用 CRISPR/Cas 體系進行 Knock out 后，會在基因組產(chǎn)生多個雙鏈斷裂，過多的 DNA 斷裂會導致細胞死亡，增加癌細胞錯誤篩選的風險，導致假陽性結(jié)果，這時候應(yīng)該優(yōu)先考慮選擇 Knock down 技術(shù)。由于基因組的基因存在功能冗余，僅僅下調(diào)單個基因的表達，可能無法觀察到表型，導致假陰性結(jié)果，這時我們可以選擇在同一細胞內(nèi)下調(diào)多個基因表達，除了操作難度很大，同時可能會像前面所說的過多的 DNA 斷裂會導致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。我們也可以選擇將功能具有冗余的基因過表達觀察表型的改變。此外，在研究特定通路與藥物協(xié)調(diào)作用的機制上過表達篩選技術(shù)具有不可以替代的作用。值得注意的是，用過表達技術(shù)去驗證 Knock down/out 的表型時，同一基因 Knock down/out 的表型與過表達的表型也不總是相反的，可能存在一致的情況，可能是由于目的基因表達的蛋白是以復合物的形式發(fā)揮功能。
小結(jié)
二代測序技術(shù)可高通量地同時對數(shù)以萬計的 DNA 分子進行測序，并提供大量信息。在混合式篩選的下游，涉及到對富集的細胞亞群內(nèi)所含 shRNA 或 sgRNA 進行定性和定量分析。NGS 技術(shù)的出現(xiàn)，大大加速了這一步驟，并顯著降低了成本，很大程度上推動了混合式篩選，減少了從靶標發(fā)現(xiàn)到藥物開發(fā)的時間。
另外，隨著 NGS 技術(shù)的不斷發(fā)展，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)也日趨成熟?；旌鲜胶Y選后所富集到的具有特定表型的細胞經(jīng) NGS 后，不僅可以提供細胞群體內(nèi) shRNA 或 sgRNA 的豐度信息，而且可以分析單個細胞的轉(zhuǎn)錄組。通過將單個細胞內(nèi)的 shRNA/sgRNA 信息與單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合，使得研究人員可以將特定的基因與細胞轉(zhuǎn)錄組發(fā)生的改變關(guān)聯(lián)起來，并方便地鑒定到功能上相互關(guān)聯(lián)的一組基因并分析其功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
參考文獻：Haley Benjamin,Roudnicky Filip,Functional Genomics for Cancer Drug Target Discovery.[J] .Cancer Cell, 2020.
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