伯豪學院

精子的生成在時間和空間上有著復雜而有序的過程?，F(xiàn)代社會男性生殖障礙的比例越來越高，而不 育癥的男性患上睪丸癌和前列腺癌的風險比正常男性更高 [Guo J et al. Cell Stem Cell. 2017]。

1）對精子進行單細胞測序，有助于了解精子成熟過程中基因重組的特征。Lu S 等人使用多次退火 循環(huán)擴增技術(shù)（MALBAC[Hou Y et al. Cell. 2013])，對精子進行單細胞全基因組 DNA（scDNA-seq）測 序，實現(xiàn)了高覆蓋度的單精子的全基因組測序 [Lu S et al. Science. 2012]。Hinch AG 等人對小 鼠精子進行 scDNA-seq，繪制了精子的高分辨率交叉圖譜和重組階段的特異性分子特征 [Hinch AG et al. Science. 2019]。

2）從單細胞水平上重建精子發(fā)育過程中細胞分化的轉(zhuǎn)錄和表達順序，對破譯男性相關(guān)的生殖障礙 有著重要的意義。Guo J 等人利用 scRNA-seq 的方法，從單細胞層面上描繪了精子干細胞在正常發(fā) 育過程中所經(jīng)歷的多階段過程，同時從基因角度詮釋了男性不育癥的原因 [Guo J et al. Cell Stem Cell. 2017]。此外，Wang M 等人對正常成年男性和梗阻性無精癥患者的睪丸組織進行了 scRNA-seq，從單細胞角度闡明了人類精子發(fā)生過程中的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡和細胞轉(zhuǎn)變（cell fate transition）的路徑，為無精癥的分子診斷和臨床治療提供了全新的視角 [Wang M et al. Cell Stem Cell. 2018]。

圖  2-1  基于  MALBAC  擴增進行單細胞全基因組  DNA  測序的基本流程

[Hou Y et al. Cell. 2013]

3）對精子進行單細胞測序也有助于探索疾病機制。一項研究顯示，對有正常后代及自閉癥后代的   人類男性精子進行單細胞 DNA 和 RNA 測序，從單細胞水平鑒定精子是否發(fā)生自閉癥相關(guān)的基因變異及基因表達差異 [Tomoiaga D et al. NPJ Genom Med. 2020]，發(fā)現(xiàn)精子中確實存在遺傳變異。這可   用于分析單個精子細胞轉(zhuǎn)錄組的基因表達和突變動力學，為疾病機制提供更深層次的見解。

卵子是人體大的細胞，在單細胞研究中有著天然的優(yōu)勢。卵細胞的單細胞測序可用于研究卵子發(fā)育過程及卵巢疾病對卵子發(fā)育的影響。

1）從單細胞水平上研究卵細胞成熟的原理。Zhao H 等人通過對體外成熟和體內(nèi)成熟的卵細胞進行 scRNA-seq 發(fā)現(xiàn) [Zhao H et al. Antioxid Redox Signal 2019]，代謝通路的改變是體內(nèi)外成熟卵母   細胞的典型差異，代謝通路關(guān)鍵分子 ACAT/HADHA-DPYD 有助于維持卵母細胞發(fā)育潛能。

2）單細胞測序可以探索激素導致的排卵異常。小鼠卵母細胞的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn) [Wang H et al. Nat Commun. 2019]，組蛋白去乙?；缚梢源龠M體外卵母細胞的成熟，為解析女性不孕提供新的方向。3）單細胞測序可用于探索卵巢相關(guān)疾病對卵細胞發(fā)育的影響。對卵巢子宮內(nèi)膜異位癥病人的卵細   胞和健康人卵細胞進行 scRNA-seq[Ferrero H et al. Hum Reprod. 2019]，發(fā)現(xiàn)差異表達的一些基因與卵細胞的低質(zhì)量有關(guān)，證實了卵巢疾病與女性不孕的相關(guān)性。

4）單細胞測序研究卵巢衰老機制。2020 年 3 月，北京大學湯富酬教授課題組與合作者利用高   精度單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù) [Si Wang et al. Cell, 2020]，繪制了食蟹猴卵巢的單細胞衰老圖譜；同時利用人類卵巢細胞研究體系，發(fā)現(xiàn)增齡伴隨的抗氧化能力的下降是靈長類卵巢衰老的主要特征之   一。該項研究在單細胞分辨率下更為高精度地揭示靈長類動物卵巢衰老的機制之一，確定了人類及其他   靈長類動物卵巢衰老的生物標志物，為開發(fā)延緩卵巢衰老及相關(guān)疾病的干預策略奠定了理論基礎。

人類胚胎在前兩個月是容易流產(chǎn)的時期。對胚胎細胞的單細胞測序，有助于探索胚胎的發(fā)育機制和影響胚胎發(fā)育的因素，為保障胚胎正常發(fā)育提供理論支持。

1）單細胞測序探索胚胎早期發(fā)育機制。湯富酬實驗室和北醫(yī)三院喬杰實驗室合作通過對人類體外   培養(yǎng)受精卵進行單細胞 DNA 或 RNA 測序 [Zhou F et al. Nature. 2019]，發(fā)現(xiàn)一些細胞在植入后會更   快地發(fā)生甲基化。小鼠、斑馬魚和青蛙早期胚胎的單細胞研究深刻地展示了胚胎發(fā)育中一些關(guān)鍵性過   程（表 2-4）。

表 2-4  部分胚胎發(fā)育領域的單細胞研究

2）評估環(huán)境因素對胚胎發(fā)育的影響。對有無尼古丁下人類胚胎干細胞衍生的胚狀體進行 scRNA-seq 發(fā)現(xiàn) [Guo H et al. Stem Cell Reports 2019]，尼古丁誘導胚狀體細胞系發(fā)生特異性反應和細胞間通   訊失調(diào)，提示尼古丁對胚胎干細胞分化有直接的不良影響，為評價藥物和環(huán)境毒性對人胚胎發(fā)育的影   響提供了一種新的方法。

單細胞技術(shù)有助提高試管嬰兒成功率。試管嬰兒是重要的輔助生殖手段，目前已經(jīng)發(fā)展到第四代，總體活胎分娩率在 40% 左右，不同試管嬰兒技術(shù)所對應的適應癥和成功率均不相同，第三代以前整體成   功率僅約為 35%。從第三代開始，加入了胚胎植入前的遺傳學診斷，使整體成功率大幅提高（約 80%）。目前，胚胎植入前遺傳學篩查（PGS）和胚胎植入前遺傳診斷（PGD）主要使用的技術(shù)有兩種，都與單細   胞技術(shù)相關(guān)：MALBAC（以及更新的 LIANTI 技術(shù)）和 MDA（多重置換擴增），分別由北京大學、北醫(yī)三院  [Huang J et al. Fertil Steril. 2014] 和華大基因 [Xu Y et al. Clin Chem. 2015]  主導研發(fā)，顯   示了單細胞測序技術(shù)在植入前遺傳學診斷臨床實踐中的潛力。

此外，體外成熟的卵母細胞發(fā)育潛能較差，流產(chǎn)率相對較高，且尚無有效改善措施。基于單細胞測   序?qū)w內(nèi)外成熟的卵細胞進行比較，為輔助生殖的持續(xù)優(yōu)化提供了理論基礎 [Zhao H et al. Antioxid Redox Signal 2019]。

目前而言，受限于價格昂貴、大眾認知不足、臨床應用不成熟以及監(jiān)管嚴格（表 2-5)，基于單細胞   技術(shù)的輔助生殖在我國的應用并不廣泛，相關(guān)產(chǎn)業(yè)還有很大的上升空間。

表  2-5  國內(nèi)十三家，首批擁有胚胎植入前篩查資質(zhì)的醫(yī)院統(tǒng)計

孕婦血漿中胎兒游離細胞以及單細胞技術(shù)的發(fā)展，為單細胞的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了可能。日本科研 人員從母體外周血樣本中提取了游離的胎兒 CD45-CD14 細胞 [Sato T et al. J Mol Diagn 2020]，使   用 scDNA-seq 對男女胎兒的遺傳信息進行了識別，展現(xiàn)了單細胞無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的潛力。目前單細胞無   創(chuàng)產(chǎn)前診斷尚未進入臨床階段。

更多伯豪生物服務